○ 유용유전자 탐색, 유용유전자 분리, 유전자 삽입 또는 융합, 형질전환, 증식 및 식물체 분화, 잡종세포 식별 및 선택, 재배시험후 품종확립

1. 조직배양

가. 재료 선정 및 캘러스 형성

1) 재료선정 : 유전자와 작물의 관계 고려

2) Embryogenic 캘러스 형성(생체중, 캘러스․배발생 캘러스 형성율)

․일반적으로 GA3 1mg/L 첨가,

․friable callus, 본엽이 종자보다 callus 유도 좋음, 종자 연구 다수

나. Embryogenic 캘러스에서 재분화 배지배지 선발 : 2,4-D와 zeatin 혼용처리(더덕)

다. 식물체 선발용 항생제배지 선발(생체중, 캘러스 형성율)

․종류별 항생제에 대한 감수성 시험 및 적정농도 선발

․캘러스가 치사하는 최소 농도 선발

․kanamycin(10, 15mg 또는 100이하), hygromycin, phosphinotricin


2. 유전자 및 벡터 탐색

가. 유전자 : 유용유전자 선발 (ex. BT)

나. 벡터 : binary vector 구입 및 구축


3. 서브클로닝 및 플라스미드 벡터 제작

․Binary vector + Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (+ 식물재료)


4. 전배양 및 아그로박테리움 배양

․전배양 : 조직배양적인 자연 치유

․아그로박테리움 배양 : 원액 또는 20-30배 희석한 액체배지 10ml에 28℃, 24hr 접종 및 증식 → 10ml 액체배지에 접종 28℃, 48hr → 플라스미드 벡터 + 형질전환 대상 시료 1min간 감염 → filter paper 5min 건조


5. 아그로박테리움과 공동배양 : 형질전환 감염시료 48hr, 25℃


6. 항생제 배지 : marker 선발(16시간), 항생제 첨가배지에 공동배양한 캘러스등을 옮겨서 형질전환체 선발(2주-4주 간격 계대)

가. 형질전환체 선발용 : kanamycin, hygromycin, phosphinotricin

나. 아그로박테리움 박멸용(with 2,4-D) : carbenicillin(500mg), cefotoxime(500mg)


7. 식물체 재분화 : marker 선발용보다 고농도의 항생제 첨가

가. 형질전환체 선발용 : kanamycin, hygromycin, phosphino tricin

나. 아그로박테리움 박멸용(with 2,4-D) : carbenicillin(2-300mg), cefotoxime(2-300mg)


8. 순화 및 형질전환체 검정

․PCR 방법 : 시료에서 genomic DNA 추출→유전자 primer(F, R)등 → PCR → 전기영동 확인