[영농활용] A Sample Preparation Protocol to DetectErwinia amylovora in Symptomless Flowers of Pears for RT-PCR

과수화상병 무병징 꽃 감염의 RT-PCR 검정을 위한 시료 전처리 방법

연구배경

• 과수화상병균의 꽃감염에 의한 병징이 발현되기 이전에 무병징 꽃에서 RT-PCR에 의한 화상병균을 사전에 효율적으로 검출하기 위한 시료의 전처리 방법 개발

주요 연구성과

• 시료 채취

• – 과수원 개화기에 과수화상병 꽃감염 여부를 검정하기 위하여 과수원에서 한주당 꽃 5개 ~10개씩 임의로 채취하여 배꽃 100개 시료를 1반복으로 총 3반복으로 시료 채취
• 시료 전처리 방법
• – 채취한 시료에서 꽃잎은 제거하고 암술, 수술을 시료(약 1.5g)로 사용
• – 암술 및 수술 시료를 3ml의 PBS buffer 넣은후 마쇄봉을 사용하여 마쇄
• – 5,000g로 원심분리후 상등액을 RT-PCR 검정
• – 100㎕ TSB 배지를 넣은 다음 24℃에서 12시간(24시간) 정치 배양
• * 배양전, 배양후 시료를 RT-PCR 검정 비교
• Tryptic Soy Broth(TSB) 배지조성 Pancreatic digest of casein, 17g; Papaic digest of soybean, 3g; Dextrose, 2.5g; Sodium chloride 5g; Dipotassium phosphate, 2.5g; 증류수, 1 리터; pH 7.0–7.2
• Phosphate buffered saline (PBS 버퍼) 1M(1×) pH 7.2(PBS): NaCl 8g; KCl 0.2g; Na2HPO₄·12H₂O 2.9g; KH₂PO₄ 0.2g; 증류수 1 리터

기대효과

• 꽃의 암술과 수술만 시료로 사용하여 전처리 과정 단순화 및 PBS 버퍼 사용량을 줄여(3ml buffer 사용) 민감도 향상